Клещевой энцефалит: Этиология. Эпидемиология и профилактика в Сибири

Структура и организация генома вируса КЭ

Мы уже упоминали о большом сходстве вирусов сем. Flaviviridae в отношении организации и экспрессии генома, стратегии репликации, высокой степени гомологии ряда белков и участков РНК [264]. Геном флавивирусов представляет собой одноцепочечную РНК размером около 11 000 нуклеотидов с константой седиментации 38—45S, что соответствует молекулярной массе (3—4)106Д, и положительной полярностью [442, 396]. Исследование структуры и функции флавивирусных геномов в последнее время значительно продвинулось вперед в результате расшифровки их нуклеотидных последовательностей. Е. Castle и др. [387—389] установили, что РНК вируса Западного Нила (ЗН) состоит из 10 960 нуклеотидов. Показано, что открытая рамка считывания генома вируса ЗН, содержащая участки кодирования структурных и неструктурных белков вируса, имеет длину 10 290 нуклеотидов, а участок, кодирующий неструктурные белки, представлен 7929 нуклеотидами.

По данным Н. Sumiyoshi с соавт. [458], общая длина РНК вируса ЯЭ составляет 10 976 нуклеотидов. В ее составе определена одна открытая рамка считывания, соответствующая полипротеину протяженностью в 3432 аминокислотных остатка. Установлен порядок расположения структурных белков в полипротеине С (начиная с N-конца), М и Е. Сделано предположение о локализации в С-концевой части полипротеина неструктурного белка РНК-зависимой РНК-полимеразы, имеющего участки гомологии с соответствующим белком ряда вирусов животных и растений. При изучении первичной структуры генома вируса денге-2 [407] обнаружено, что РНК вируса длиной 10 703 нуклеотида кодирует один полипротеин, который затем расщепляется на структурные и неструктурные белки. Гомология белков вируса денге-2 с белками вируса ЖЛ — 45 %, а вируса ЗН — 51 %. Полная нуклеотидная последовательность вируса Канджин (К) составляет 10 664 нуклеотида и содержит одну открытую рамку считывания для полипротеина, включающего 3433 аминокислотных остатка [395]. Определен порядок генов вируса Канджин и сопоставлен со структурой генома вируса ЖЛ:

К 5'—С—GP20—Е—GP44—Р19—Р10—Р71 —(?)—Р21—Р98—3'
ЖЛ5'—С—ргМ—Е—NS1— nS2a—nS2b—NS3—nS4a—nS4b—NS5—3'

Сравнение полных аминокислотных последовательностей белков вирусов Канджин, ЗН и ЖЛ показало высокую степень гомологии двух первых — 93 % и менее выраженную (46 %) — последнего. Согласно [406], протяженность генома вируса ЖЛ составляет 10 862 нуклеотида.

Характеризуя организацию генома и стратегию трансляции у флавивирусов, Е. Castle и др. [389] отмечают, что РНК этих вирусов транслируются в один полипротеин, который затем подвергается процессингу под действием клеточной сигналазы и, возможно, вирусспецифической протеазы с образованием структурных и неструктурных беЛков. Порядок расположения цистронов в геноме флавивирусов следующий:

5'—С—ргМ—Е—NS1—NSX—NS3—NS4—NS5—3'.

Таким образом, как следует из приведенных данных, флавивирусы имеют одну открытую рамку трансляции, которая покрывает кодирующую область генома, включающую гены структурных и неструктурных белков. Что касается 5'- и 3'-концов РНК, они являются нетранслируемыми областями генома. Сопоставляя нуклеотидные последовательности 5'-концевых областей пяти флавивирусов, М. Brinton и J. Dispoto [383] обнаружили, что лишь небольшие участки их консервативны для разных вирусов. В то же время гомология 5'-концов у вирусов — представителей одной серогруппы — весьма высока, а у штаммов одного вируса — почти полная. Отмечено, что три штамма вируса энцефалита Сан-Луи с ослабленной вирулентностью содержали нуклеотидную замену в одном и том же положении 16. Авторы считают, что, несмотря на различия в первичной структуре 5'-концевого района .генома флавивирусов, вторичная структура этой области имеет общие организацию и размеры и представляет собой "шпилечно-петлевую" структуру. Подобные образования состоят из двухцепочечной шпильки, имеющей верхний и боковой неспаренные участки (петли). Такая же шпилечная структура описана для 3'-концевого района РНК вирусов ЗН, энцефалита Сан-Луи и ЖЛ [382, 384]. Эти консервативные последовательности, вероятно, могут служить сигналами узнавания и связывания вирусной полимеразы.

Исследование первичной структуры генома вируса КЭ было предпринято М.П. Чумаковым и др., А.Г. Плетневым и др. [263—267, 378, 431, 432, 471], С. Mandl и др. [428], а также П.Ф. Сафроновым и др. [288]. Как установлено А.Г. Плетневым и его группой, полная длина генома вируса КЭ составляет 10 480 оснований. Подобно геному других флавивирусов, геномная РНК вируса КЭ включает открытую рамку считывания, которая простирается от 127- до 10 365-го нуклеотидного остатка и способна кодировать 3413 аминокислотных остатков. Транслируемый полипротеин-предшественник, по-видимому, расщепляется протеолитически в соответствии с механизмом, описанным для других флавивирусов. Гены структурных белков вируса клещевого энцефалита образуют 5'-концевой кластер, занимающий четвертую часть вирусного генома. Три четверти генома со стороны 3'-концевой части заняты генами неструктурных белков. Порядок их в геноме вируса КЭ определен следующим образом:

5' — С — ргМ(М) — Е — NS1 — NS2A — NS2B — — NS3 — NS4A — NS4B — NS5 — 3'.

Проведена оценка гомологии полипротеинов вируса КЭ и некоторых флавивирусов на основании сопоставления аминокислотных последовательностей, выведенных по первичным структурам геномов. Согласно полученным данным, наиболее близким к вирусу КЭ является вирус ЖЛ. 5'- и 3'-концевые участки генома вируса клещевого энцефалита — это нетранслируемые области, представленные шпилечно-петлевыми структурами. Полагают, что структура подобного типа может играть определенную роль в инициации трансляции.

С. Mandl и др. [428] сообщили о клонировании генома вируса КЭ (штамм Найдорф, западный субтип) и секвенировании 5'-концевой области длиной 2450 нуклеотидов. В результате выведения аминокислотной последовательности и сопоставления ее с последовательностями других флавивирусов сделано заключение о согласованности полученных данных с серологической классификацией семейства флавивирусов. Сайты N-гликозилирования у членов одной серологической подгруппы в большей степени консервативны, чем у представителей разных подгрупп. Далее была определена первичная последовательность нуклеотидов области генома того же штамма, кодирующая неструктурные белки вируса. На основании выведенных аминокислотных последовательностей установлена гомология между семью неструктурными белками этого вируса и ряда "комариных" флавивирусов, относящихся к разным антигенным комплексам (их структуры взяты из опубликованных работ). Построено эволюционное дерево флавивирусов по аминокислотным последовательностям белка NS1, на котором четко прослеживаются более тесные взаимоотношения внутри вирусов комплексов денге (1-, 2- и 4-й серотипы), ЯЭ (ЯЭ, ЭДМ, ЭСЛ, ЗН, Канджин), ЖЛ и КЭ (западный и восточный подтипы).

П.Ф. Сафроновым и др. [288] определена полная первичная структура генома штамма 205, изолированного на Дальнем Востоке и антигенно близкого прототипному штамму Софьин. Авторы оценили уровни гомологии трех штаммов вируса клещевого энцефалита по нуклеотидным (числитель) и аминокислотным (знаменатель) последовательностям в геноме ВКЭ, % [по 288]:

205 и Софьин 205 и Найдорф Софьин и Найдорф 4,6/1,8 16,9/6,9 16,8/7,2

Как видно из сравнительных данных, различия в нуклеотидной или аминокислотной последовательностях двух дальневосточных штаммов невелики и укладываются в рамки обычных межштаммовых различий, принятых при оценке гомологии геномов флавивирусов. Различия между дальневосточными штаммами вируса КЭ и западным штаммом Найдорф весьма существенны и приближаются к видовым некоторых флавивирусов. Так, мы уже упоминали, что гомология белков вирусов ЗН и Канджин была равна 93 %, т.е. практически не отличалась от уровня гомологии между белками штаммов Софьин и Найдорф или 205 и Найдорф. Таким образом, результаты молекулярно-биологических исследований дальневосточного и западного подтипов вируса клещевого энцефалита дают дополнительную пищу для размышлений об их положении в классификации вирусов комплекса клещевого энцефалита.

Сведения об уровне гомологии геномов вирусов комплекса КЭ первоначально были получены на основании молекулярного зондирования. В совместной работе с В.А. Шаманиным и А.Г. Плетневым [357, 447] нами в гибридизационных опытах использованы зонды, представляющие собой ДНК рекомбинантных плазмид, полученных в результате клонирования геномной РНК вируса КЭ, штамм Софьин. Показано, что зонд рВКЭ интенсивно гибридизовался с РНК штамма Софьин вируса КЭ и в той или иной степени с вирусами комплекса КЭ Негиши, ШЭО, ОГЛ, КЛБ, Лангат. Гибридизация с вирусом Повассан из комплекса КЭ и флавивирусами Западного Нила, Долины Мюррея, Сан-Луи, ЯЭ, денге-2, ЖЛ, а также тогавирусом Лесов Семлики отсутствовала. Образцы РНК вирусов комплекса КЭ гибридизованы с кДНК-зондом в разных условиях. Молекулярная гибридизация в водном растворе при 65 °С и в 50 % -м формамиде при 30—50 °С была положительной со всеми вирусами комплекса КЭ, за исключении вируса Повассан. В условиях гибридизации при 60 °С в 50 %-м формамиде кДНК-зонд реагировал с РНК вирусов КЭ, Негиши, ШЭО, но не вирусов ОГЛ, КЛБ, Лангат и Повассан. Повышение температуры гибридизации до 65 °С в присутствии формамида приводит к моноспецифической реакции с вирусом клещевого энцефалита. Таким образом, можно заключить, что уровень гомологии геномов вирусов комплекса клещевого энцефалита и ряда других флавивирусов, определенный методом молекулярной гибридизации, коррелировал с результатами иммунотипирования флавивирусов, на основании которых была сформирована антигенная группа вирусов клещевого энцефалита. Получены данные о степени генетического родства этих вирусов, из которых следует, что в наибольшей мере к вирусу КЭ приближаются вирусы ШЭО и Негиши, а вирусы ОГЛ, КЛБ и Лангат менее с ними связаны. Интересно отметить, что наиболее тесное антигенное родство среди вирусов комплекса КЭ выявлено у вирусов КЭ, ШЭО и Негиши еще D. Clarke в 1964 г. [393] в реакции торможения гемагглютинации с адсорбированными типоспецифическими антисыворотками. М. Gresikova и М. Sekeyova [84], анализируя антигенные взаимоотношения вирусов комплекса КЭ в опытах с моноклональными антителами, показали тесные связи между вирусами КЭ, Негиши, ШЭО и ОГЛ.

Сравнительные характеристики взаимосвязей вирусов комплекса КЭ дополнены и уточнены в последнее время с помощью анализа первичных структур их геномов или фрагментов геномов. М. Marin и др. [429], изучая эволюционные взаимоотношения вирусов Тюлений и Саумарец Риф - с другими флавивирусами, на основании оценки аминокислотных последовательностей белка Е показали, что эти два вируса составляют самостоятельную подгруппу в семействе флавивирусов, так же как подгруппы вирусов КЭ, ЯЭ, денге и неклассифицированный вирус ЖЛ. Вирусы, входящие в подгруппу КЭ, по степени родства расположились следующим образом: вирус ШЭО -» вирус испанского энцефалита овец -» вирус западного КЭ -» вирус турецкого энцефалита овец -» вирус дальневосточного КЭ -» вирус ОГЛ -» вирус Лангат -» вирус КЛБ -» вирус Повассан. Заслуживает внимания возможность по-новому классифицировать некоторые из них в результате сравнения первичных структур геномов вирусов этой группы. Так, было показано, что вирус Негиши настолько близко родствен вирусу ШЭО, что он должен рассматриваться не как самостоятельный, а как вариант последнего.

Таким образом, новые исследования эволюционных взаимоотношений между вирусами путем характеристики гомологии их геномов дают материал для переоценки некоторых сложившихся схем классификации вирусов внутри семейств. Возникает вопрос, следует ли молекулярно-биологическим данным отдавать приоритет по сравнению с результатами антигенного анализа вирусов. Ответа пока нет, однако он назрел в связи с преобладанием в последнее время работ именно такого свойства и накоплением данных по генотипированию различных вирусов. По-видимому, нельзя не учитывать, что при всей важности регистрации антигенных свойств вирусов с помощью серологических тестов или моноклональных антител антигенные свойства вирусов закодированы в их геномах.