Клещевой энцефалит: Этиология. Эпидемиология и профилактика в Сибири
2.3. Молекулярная эпидемиология вируса клещевого энцефалита
Развитие этого современного направления вирусологии и эпидемиологии стало возможным благодаря прогрессу методов молекулярной биологии и биотехнологии и их внедрению в изучение вирусов. Сравнительная характеристика вирусных геномов, их фрагментов, вирусспецифических белков и отдельных антигенных детерминант позволяет по-новому, базируясь на фундаментальных данных, оценивать генетический состав и генетическую вариабельность природных вирусных популяций. Молекулярно-эпидемиологические исследования имеют большую научную ценность, так как дают важную информацию для рассмотрения вопросов происхождения, родства, эволюции и, возможно, прогноза изменчивости различных вирусов. В то же время вполне отчетливо виден прикладной аспект таких работ, который выражается в возможности оценки как общих тенденций, так и частных проявлений распространения генетических типов вирусов в природе и расшифровки их эпидемических проявлений в той или иной конкретной ситуации. Данные о природной генетической вариабельности вирусов имеют существенное значение для характеристики и повышения эффективности диагностики, профилактики и специфической терапии вирусных заболеваний.
Первый этап в исследованиях молекулярной эпидемиологии флавивирусов связан с использованием метода олигонуклеотидных фингерпринтов. Так, D. Trent и др. [461] обнаружили, что 57 штаммов вируса энцефалита Сан-Луи (ЭСЛ), выделенных от людей, грызунов и комаров, существенно варьировали по олигонуклеотидным картам, полученным в результате переваривания вирионной РНК Т1-РНКазой. В зависимости от места выделения штаммы удалось разделить на две генетические группы (два топотипа): 1) изоляты из атлантических штатов США и 2) изоляты из Флориды и западных штатов США. Внутри каждого топотипа штаммы различались по степени вирулентности. В результате изучения генетических вариантов вируса денге-2 эти же авторы [460], а затем Т. Monath и др. [430], используя олигонуклеотидное картирование и анализ антигенной сигнатуры, осуществили его географическую классификацию. Выделены следующие топотипы: 1) Бирма-Таиланд (8 штаммов), 2) Пуэрто-Рико и Карибские штаммы (12), 3) Ямайка (4), 4) Новая Гвинея (1), Филиппины (1). Н. Hori и др. [417, 418] исследовали генетическую вариабельность вируса ЯЭ с помощью олигонуклеотидного картирования 42S РНК. Выяснилось, что японские штаммы сходны между собой, но обладают выраженными отличиями от штаммов, изолированных во Вьетнаме и Таиланде. Обнаружены также геномные различия у штаммов из одного и того же района, но выделенных в разные сезоны, а также с разными циклами пассирования в клетках или головном мозге мышей. Вместе с тем указывается, что изменений, происходящих при адаптации штаммов, недостаточно для объяснения различий, выявляемых для изолятов. Есть сообщения о генетических вариантах вируса энцефалита Долины Мюррея и о генетической однородности штаммов вируса Канджин, выделенных в Австралии в течение 25 лет [394, 422, 424]. При этом использовалась и другая методика, а именно сравнение НаеIII TaqI профилей фрагментов рестрикции к ДНК.
В литературе имеются данные о применении метода олигопептидного картирования, панелей моноклональных антител, а также молекулярных зондов для дифференциации и генетического типирования вирусов различных таксономических групп. При изучении методом пептидных карт некоторых вирусных белков [473, 47] показано, что набор пептидов разных штаммов вируса клещевого энцефалита весьма схож, но позволяет дифференцировать европейские штаммы от восточных. В.М. Жданов и др. [113], изучавшие по олигопептидным картам различия вирусов комплекса КЭ, отметили, что вирусы КЭ (восточный и западный варианты), Лангат и Повассан обнаруживали значительную гомогенность, выражавшуюся в наличии общего каркаса олигопептидов. Вместе с тем они имели свои собственные пептиды, отсутствующие у других вирусов, что позволило разделить их на несколько групп: вирусы собственно клещевой энцефалит, вирусы Лангат и Повассан, ШЭО, Негиши. Нейровирулентные штаммы вируса клещевого энцефалита (Софьин, Абсеттаров) отличались от штаммов с менее выраженной вирулентностью (штамм 256). 12 штаммов вируса КЭ, изолированных из различных районов бывшего СССР, сравнивали с прототипным штаммом западного подтипа Найдорф методом олигопептидного картирования [416]. Были получены весьма неординарные результаты, свидетельствующие о возможности циркуляции штаммов, сходных с европейскими, не только в Латвии, Белоруссии и на северо-западе России, но также на Урале и даже в Приморском крае. Как показано ниже, эти данные не являются случайными. Похожие результаты в последующем были продемонстрированы с помощью других методов.
Данные исследования генетической гетерогенности штаммов вируса КЭ, изолированных в течение 26 лет в странах Западной и Центральной Европы от различных хозяев, с набором МкАт к гликопротеину Е совпали с уже упоминавшимися результатами пептидного картирования, а также данными радиоиммунного исследования [474]. Авторами [453] с помощью МкАт, полученных к одному из австрийских штаммов вируса клещевого энцефалита, были изучены антигенные свойства трех штаммов из Австрии и по одному из Турции, бывших Чехословакии и СССР (Софьин). Различия в титрах МкАт со штаммами, выделенными в Австрии, определенные с помощью иммуноферментного анализа, оказались значительно менее выраженными, чем со штаммами из других стран. Отмечено, что изменчивость антигенной структуры штаммов связана с эпитопами полипептида с м.м. 58 кД, сходного с поверхностным гликопротеином Е.
Полученные S. Gaidamovich и др. [401] МкАт к штамму 4072, выделенному от больного в СССР, и штамму Scalica вируса КЭ, изолированному в бывшей Чехословакии от грызуна, реагировали неодинаково с вирусами комплекса КЭ. Если антитела к штамму Scalica проявляли активность в ИФ и РСК со всеми членами комплекса КЭ, кроме вируса Повассан, то антитела к штамму 4072 не были активны в РСК и не реагировали в ИФ с вирусами Лангат, Повассан и штаммом Scalica. На основании полученных результатов авторы предположили, что последний является самостоятельным членом антигенной группы вирусов клещевого энцефалита. М. Gresikova и М. Sekeyova [84] дифференцировали с помощью МкАт штамм Scalica от вирусов Лангат, ШЭО и ОГЛ. В то же время в работе [404], посвященной изучению взаимоотношений между вирусами Scalica, Лангат, европейским и дальневосточным подтипами вируса КЭ, вирусом ШЭО, с помощью 22 МкАт, пептидного картирования и секвенирования вирусных РНК, установлено, что вирус Scalica отличается от вируса клещевого энцефалита, но весьма схож с вирусом Лангат. В частности, показано, что при сравнении фрагментов геномов этих вирусов длиной 416 оснований гомология аминокислотных последовательностей вируса Scalica и вируса КЭ составила 85 %, а гомология между европейским и дальневосточным подтипами вируса КЭ — 93 %.
Моноклональные антитела были использованы также для характеристики антигенных различий штаммов вируса КЭ, выделенных в различных районах бывшего СССР [321]. Панель из 16 МкАт к западному вирусу Найдорф тестирована с восьмью штаммами с помощью ИФА. В результате выявлено, что штаммы Абсеттаров и 256 западного серотипа идентичны австрийскому штамму Найдорф, штамм 132 восточного серотипа очень слабо от него отличался по двум МкАт домена А, четыре штамма, выделенных в Латвии, Крыму и на Урале, имели редукцию связывания МкАт доменов А и С и, наконец, штамм Еланцев из Тюменской области связывался только с тремя МкАт из 16 (домен А). Кстати, этот штамм, известный тем, что его использовали в качестве естественно аттенуированного варианта для вакцинации людей, был впоследствии отнесен к вирусу Лангат сначала по данным антигенного анализа, а затем в результате сопоставления нуклеотидных последовательностей. А.С. Караванов и др. [135] для изучения вариабельности антигенной структуры более чем 100 штаммов вируса КЭ, изолированных из материалов природных очагов в Прибалтике, на Урале, в Западной и Восточной Сибири, на Дальнем Востоке и в Крыму, применили панель МкАт, полученных к основному гликопротеину Е дальневосточного штамма Софьин [215]. Авторы отметили, что большая часть изученных штаммов обладала антигенной консервативностью. Выявлена группа штаммов, с которыми отдельные МкАт не вступали во взаимодействие и не образовывали специфических комплексов. Вторая группа штаммов отличалась от штамма Софьин только плотностью сигнала и характеризовалась низким коэффициентом связывания. Отметим, что обнаружено антигенное единообразие по топологической структуре изолятов из очагов Западной Сибири. В этой группе выявлено только 0,5—1 % штаммов с различиями в степени связывания с МкАт. Однако из публикации осталось неясным, в какой мере такие столь близкие друг другу штаммы приближались или удалялись от дальневосточного прототипного штамма Софьин.
Сотрудниками нашей лаборатории (Ю.П. Джиоев, И.В. Воронко, И.В. Козлова, М.М. Верхозина, Т.В. Демина) совместно с сотрудниками Новосибирского института биоорганической химии СО РАН (А.Г. Плетнев, В.А. Шаманин), Омского НИИ природно-очаговых инфекций ГК СЭН (Д.А. Дрокин), Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (В.В. Погодина, Н.Г. Бочкова, Г.Г. Карганова, Т.И. Дживанян, В.А. Лашкевич) осуществлен цикл работ по изучению возможности применения генетических зондов для характеристики различных аспектов изменчивости вируса клещевого энцефалита как в природных, так и в лабораторных условиях. Основой для исследований послужили фундаментальные труды А.Г. Плетнева и др. [264, 266, 431, 432] по расшифровке нуклеотидной последовательности генома вируса клещевого энцефалита, а также разработка метода молекулярной гибридизации для детекции этого вируса.
Использовано два типа зондов: кДНК-зонд, представляющий собой комплементарные копии трех фрагментов геномной РНК вируса КЭ, штамм Софьин в составе рекомбинантных плазмид, суммарно перекрывающие около половины вирусного генома со стороны 5'-конца, а также синтетические дезоксиолигонуклеотидные зонды длиной 18—26 нуклеотидов, комплементарные различным участкам РНК вируса КЭ. В предварительных опытах установлена возможность подобрать такие условия гибридизации кДНК-зонда и РНК штаммов, чтобы гибридизация происходила только со штаммами, обладающими высокой степенью гомологии с зондом. Столь "жесткие" условия гибридизации предусматривали проведение процедуры при 60 или 65 °С в присутствии 50%-го формамида. С другой стороны, 10 синтетических дезоксиолигонуклеотидов были получены с учетом консервативности или вариабельности тех или иных участков вирусного генома, определенных при сравнительном компьютерном анализе первичных геномных структур ряда флавивирусов. В результате оценки гибридизующей способности олигонуклеотидных зондов с РНК 143 штаммов вируса КЭ показано, что они могут в разной степени гибридизоваться с РНК штаммов: наиболее "консервативный" зонд S5 — в 100 % случаев, наиболее "вариабельные" зонды (группа Б) — в 12—15 % и умеренно "вариабельные" (группа А) — в 35—53 % случаев. Кроме того, использовали два олигонуклеотидных зонда, специфичных для западного штамма Найдорф, полученных нами после сравнения нуклеотидных последовательностей геномов дальневосточного и западного вирусов КЭ. На основании способности РНК штаммов гибридизоваться с кДНК-зондом в "жестких" условиях, а также с "консервативным", "вариабельными" и Найдорф-специфичными олигонуклеотидными зондами штаммы относили к одному из шести условно выделенных генетических вариантов [121, 123, 124].
В табл. 5 приведены критерии отнесения штамма к тому или иному генетическому варианту.
Генетическую вариабельность природных популяций вируса КЭ изучали с помощью коллекции из 200 штаммов, изолированных нами из различных эндемичных районов бывшего СССР — от Приморья на востоке до Западной Украины и Калининградской области на западе, Крыма и Киргизии на юге [123, 124]. Получены следующие основные результаты:
1) продемонстрировано распространение различных генетических вариантов вируса клещевого энцефалита на территории Азии и Восточной Европы (рис. 4);
2) показано, что штаммы, подобные прототипному штамму Софьин дальневосточного подтипа, составляли всего 16 % изученной коллекции и встречались преимущественно на Дальнем Востоке, реже — в западной части обследованного ареала и совсем редко — в Центральном районе, на Урале и в Сибири;
3) выявлено, что штаммы, обладающие некоторыми геномными последовательностями, характерными для европейского штамма Найдорф, распространены на восток по крайней мере до территории Западной Сибири (Новосибирская область, Алтайский край);
4) установлено, что генетические различия между штаммами могут быть очень сильно выраженными, достигая уровней видовых различий между некоторыми представителями комплекса вирусов клещевого энцефалита.
Для оценки достоверности сделанных выводов предпринята специальная работа, охарактеризовавшая генетическую стабильность штаммов в процессе лабораторных пассажей [101]. Изучали генетические изменения штаммов вируса клещевого энцефалита, прошедших 1 —17 пассажей через мозг белых мышей. Отмечено, что изменения геномов свежевыделенных штаммов вируса клещевого энцефалита при пассажах через мозг белых мышей происходят на уровне различий в гибридизации с 1—2 олигонуклеотидными зондами (из 10) и не выходят за пределы вариабельности штаммов, отнесенных к одному генетическому варианту. Это свидетельствует о том, что с помощью зондов выявлены штаммовые различия, которые не могут быть объяснены влиянием лабораторных пассажей. Относительно использованной генетической классификации штаммов заметим, что она носит достаточно условный характер, так как была основана на степени сходства или отличия штаммов от прототипного дальневосточного вируса Софьин и отчасти западного штамма Найдорф, и, таким образом, не могла характеризовать индивидуальное "лицо" того или иного генетического варианта. Очевидно, для разработки классификации, отвечающей данному требованию, необходимо сравнение нуклеотидных или аминокислотных последовательностей значительного числа природных изолятов из разных участков ареала вируса клещевого энцефалита.
Дезоксиолигонуклеотидные зонды были применены также для изучения возможности циркуляции на территории России штаммов, подобных греческому штамму Вергина [268, 269], обладающему своеобразной антигенной характеристикой и образовавшему самостоятельный антигенный подтип вируса КЭ [351]. Оказалось, что по картине гибридизации с зондами этот штамм был отнесен к VI генетическому варианту, который доминирует в Удмуртии, распространен на Алтае, в Западной Сибири, на западе Восточно-Европейской равнины. Установлено сходство штамма Вергина с некоторыми штаммами вируса КЭ, выделенными в России, по антигенным свойствам. По комплексу признаков штамм Вергина наиболее близок штамму Яр-90, изолированному в Ярославской области. Изучением сывороток крови местных жителей в 1992—1993 гг. выявлено доминирование вируснейтрализующих антител к штаммам Вергина и Яр-90 (23,1 и 17,5 % соответственно), тогда как к штамму Софьин антитела обнаружены в 13,6 %, а к штамму Яр-173 — в 9,3 %. У 10 больных энцефалитом наблюдали избирательное нарастание вируснейтрализующих антител к штаммам Вергина и Яр-90 без сероконверсии к другим штаммам вируса клещевого энцефалита.
Работы последних лет, посвященные изучению генетической вариабельности вирусов, в частности флавивирусов, большей частью основаны на сопоставлении нуклеотидных последовательностей фрагментов геномов или выведенных аминокислотных последовательностей природных вирусных изолятов. Такой подход к выявлению гетерогенности и классификации вирусов внутри видов связан с развитием новых, более совершенных методов исследования, дающих объективную информацию относительно их генетических различий. Подобный анализ имеет важное значение не только для эпидемиологии, но и для систематики вирусов.
М. Lobigs и др. [423] секвенировали ген белка Е 11 штаммов вируса ЭДМ, выделенных из различных источников в течение 25 лет на территории Австралии и Папуа Новая Гвинея. При сравнении нуклеотидных последовательностей показано, что австралийские штаммы были весьма сходными (не более 1,7 % расхождений нуклеотидных оснований). Два штамма из Папуа Новая Гвинея различались между собой по гену белка Е на 6,8 %, а с каждым из австралийских штаммов — на 9—10 %. Таким образом, данные тех же авторов, полученные ранее с помощью НаеШ рестрикции кДНК-копий вирионных РНК, были полностью подтверждены. Генетическую вариабельность вируса ЯЭ в природе изучали на материале 46 штаммов из различных районов Азии [390]. С учетом 12%-й дивергенции нуклеотидных оснований (при сравнении участка гена ргМ длиной 240 оснований) как предельного уровня, свидетельствующего о тесном родстве между изолятами, последние были разделены на три генотипические группы. Первая включала изоляты из северного Таиланда и Камбоджи, вторая — из южного Таиланда, Малайзии, Саравака и Индонезии, третья — из Японии, Китая, Тайваня, Филиппин, Шри Ланки, Индии и Непала. Показано, что сравнение коротких нуклеотидных последовательностей может послужить пониманию эволюции вируса ЯЭ, его распространения и, возможно, патогенеза. Высокий уровень гомологии пяти штаммов вируса ЯЭ, изолированных в Японии и Китае между 1935 и 1982 гг., на уровне более 93 % был продемонстрирован при сравнении нуклеотидных и аминокислотных последовательностей как структурных, так и неструктурных вирусных белков [459]. Авторы полагают, что гомология аминокислотных последовательностей в 93 % может быть принята как индикатор для вирусов, относящихся к одному и тому же виду. При изучении фрагмента генома длиной 182 основания семи изолятов из шести стран флавивируса Западного Нила [433] выявлены различия их нуклеотидных последовательностей, позволившие сформировать три группы. В первой группе оказались изоляты, обладающие гомологией на уровне 92—98 %. Во вторую группу вошли два африканских изолята из Уганды и Нигерии с чрезвычайно высокой степенью гомологии (99,5 %). Изолят с Мадагаскара образовал третью группу, так как существенно отличался от других: от 77 до 86 % гомологии. Исследования молекулярной эпидемиологии флавивирусов были продолжены с 35 штаммами вируса денге-1, изолированными в течение 50 лет, и 28 — денге-4, выделенными за 35 лет [392]. При анализе нуклеотидных последовательностей фрагмента гена белка Е, кодирующего аминокислоты 28—87, обнаружены вариации в 6,9 % для вирусов денге-1 и 4,9 % — денге-4. Вариации в 6 % и более использованы в качестве критерия разделения штаммов на генотипы. Вирусы денге-1 составили три генотипа, а денге-4 были отнесены к одному генотипу.
Недавно изучение природной генетической изменчивости вируса КЭ на основании сравнения первичных структур фрагментов генома штаммов, изолированных в разных участках ареала, начато в нашей лаборатории. В первой серии экспериментов получены с помощью ПЦР и секвенированы фрагменты гена белка Е длиной 160 нуклеотидов пяти штаммов: Преголя-8 (Калининградская область), Сестрорецк-2 (Ленинградская область), Новгород-2 (Новгородская область), Ельцовка-1 (Новосибирская область), Бузуучук (Киргизия). Все штаммы выделены из клещей в 1985— 1986 гг. Нуклеотидные последовательности фрагмента гена белка Е штаммов сравнивали между собой и с опубликованными данными штаммов Софьин (дальневосточный подтип), Найдорф (западный подтип), вирусов комплекса клещевого энцефалита ШЭО и Лангат. В табл. 6 показана гомология участка геномов этих вирусов.
Как видно, только штамм Преголя-8 обладал высокой степенью гомологии со штаммом Софьин (98 %) и, таким образом, они оба составили первую генотипическую группу. Интересно, что эти два штамма выделены на огромном удалении друг от друга и с большим разрывом во времени. Напомним, что возможность изоляции штаммов, подобных дальневосточному прототипному штамму Софьин в западной части ареала и, наоборот, штаммов с признаками, свойственными западному подтипу вируса клещевого энцефалита, — в восточной, ранее была показана другими исследователями и другими методами. Во вторую группу вошел один штамм Найдорф — представитель западного подтипа. Уровень его гомологии по анализируемому фрагменту генома с другими штаммами вируса КЭ составил от 82 до 88 %. Четыре штамма, выделенных в Северо-Западном районе, в Западной Сибири и Киргизии, продемонстрировали выраженное сходство между собой (94—98 %) и в то же время существенное отличие от штаммов первых двух групп (82—85 % гомологии). Эти штаммы образовали третью генотипическую группу. Вирусы ШЭО и Лангат отличались от других анализируемых, однако в некоторых случаях различия между штаммами вируса КЭ и вирусом ШЭО были на одном уровне.
На рис. 5 представлено эволюционное дерево, построенное с помощью компьютерной программы FITCH, которое иллюстрирует изложенные выше материалы.
Нами получены результаты исследования еще одного штамма вируса КЭ 178/79, выделенного в Восточной Сибири и отнесенного по антигенной характеристике к восточно-сибирскому, или среднесибирско-забайкальскому серотипу [273]. Установлено, что указанный штамм существенно отличался от описанных выше и образовывал самостоятельную генотипическую группу. Другой штамм Байкал-3 примкнул к штаммам третьего генотипа.
Таким образом, если суммировать уже полученные результаты генетического типирования вируса КЭ на основании сравнения геномных структур различных изолятов, можно выделить четыре его генетических типа. Весьма существенно, что эти типы фактически совпадают с антигенными подтипами, выявленными ранее разными авторами с помощью различных методов. Итак, это генотип 1, соответствующий дальневосточному антигенному подтипу; генотип 2, описанный как западный (центрально-европейский) подтип; генотип 3, по-видимому, широко распространенный в различных участках ареала и включающий штаммы урало-сибирского антигенного подтипа; наконец, генотип 4 — восточно-сибирский, или Айна/1448, подтип.
Пока нет достаточных оснований считать, что число генотипов вируса клещевого энцефалита ограничивается четырьмя: число исследованных штаммов совершенно недостаточно, учитывая огромный ареал вируса и разнообразие условий его циркуляции в природе. Не ясно, какое положение в данной классификации займут Вергина-подобные штаммы. Да и вообще вопросы корреляции между генетическими типами и антигенными вариантами требуют дальнейшего изучения.
Иными словами, задачей ближайшего будущего является генетическое типирование представительной коллекции изолятов вируса клещевого энцефалита из разных районов его циркуляции, что будет способствовать более ясному пониманию взаимоотношений вирусов комплекса клещевого энцефалита и их эволюции, адекватной классификации этих вирусов. Практическое значение таких данных состоит в возможности оценки уровней природной вариабельности и географического распространения генетических типов вируса с точки зрения создания более эффективных средств специфической профилактики и лабораторной диагностики клещевого энцефалита.