Изучение генетического разнообразия анаплазм и эрлихий

Рар В.А.(1), Ливанова Н.Н.(2), Панов В.В.(2), Астанин В.Б.(3), Ливанов С.Г.(2), Морозова О.В.(1)

The study of anaplasma and ehrlichia genetic variability in parasitic systems in the South-Western Siberia and Ural Rar V.A., Livanova N.N., Panov V.V., Astanin V.B., Livanov S.G., Morozova O.V.
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск
2 Институт систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск
3 Территориальное управление Роспотребнадзора по Новосибирской области

-----------------------------------------------------------------

ДНК Ehrlichia muris и Anaplasma phagocytophilum была обнаружена методом nested ПЦР в клещах Ixodes persulcatus, собранных в Новосибирской, Свердловской и Челябинской областях, и в образцах крови мелких млекопитающих, отловленных в Новосибирской и Свердловской областях. На территории Новосибирской области в образцах крови и клещах было выявлено два генетических варианта A. phagocytophilum. Ключевые слова: Ehrlichia muris, Anaplasma phagocytophilum, ПЦР, Ixodes persulcatus, мелкие млекопитающие, генетические варианты. Ehrlichia muris and Anaplasma phagocytophilum DNA were detected using nested PCR among Ixodes persulcatus collected in Novosibirsk, Sverdlovsk and Chelyabinsk regions and in blood samples of small mammals from Novosibirsk and Sverdlovsk regions. Two genetic variants of A. phagocytophilum were revealed in blood samples and ticks from Novosibirsk region. Key words: Ehrlichia muris, Anaplasma phagocytophilum, PCR, Ixodes persulcatus, small mammals, genetic variants.

-----------------------------------------------------------------

Эрлихиозы и анаплазиозы являются трансмиссивными природноочаговыми инфекциями. Представители родов Ehrlichia и Anaplasma, относящиеся к семейству Anaplasmataceae, представляют собой маленькие грамотрицательные кокки, локализованные чаще всего внутри фагосом лейкоцитов. Внутрифагосомальные эрлихии делятся, образуя кластеры клеток, или так называемые морулы, выявляемые микроскопически после окрашивания по Гимзе. [23].

Эрлихиозные и анаплазмозные инфекции у домашних животных были описаны еще в середине ХХ в., однако широкий интерес к изучению эрлихий и анаплазм возник после обнаружения в семействе Anaplasmataceae патогенных для человека видов в 1987—1994 гг.

В настоящее время известно три инфекционных агента, вызывающих эрлихиозы и анаплазмозы у людей. Ehrlichia chaffeensis поражает мононуклеарные лейкоциты, вызывая моноцитарный эрлихиоз человека [16], а Ehrlichia ewingii и Anaplasma phagocytophilum — гранулоцитарные лейкоциты, вызывая гранулоцитарный эрлихиоз и анаплазмоз человека [12, 15]. A. phagocytophilum — новое название вида, присвоенное после проведенного филогенетического анализа представителей семейства Anaplasmataceae, объединившего в себе микроорганизмы, ранее известные как Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichiaeque и HGE-агент [17].

Клинические проявления заболеваний неспецифичны и являются грииппоподобными. У больных наблюдаются острая лихорадка, сильная головная боль, боли в мышцах, тошнота. При лабораторном исследовании выявляются уменьшение числа лейкоцитов и тромбоцитов, а также повышение активности аминотрансферазы [9]. В США было зарегестрировано 338 подтвержденных случаев моноцитарного эрлихиоза человека (в 1997—2001 гг.) и 654 случая гранулоцитарного анаплазмоза человека (в 1994—2001 гг.), при этом смертность составляла около 1%. В Европе выявлено около 20 случаев гранулоцитарного анаплазмоза у людей [23].

Переносчиками A. phagocytophilum в США являются клещи Ixodes scapularis и Ixodes pacificus [9, 18, 28], а в Европе — лесной клещ Ixodes ricinus [20, 22]. На севере США от 7,6 до 53,0% взрослых клещей I. scapularis и от 1,5 до 20,6% нимф инфицированы A. phagocytophilum [20, 28]. В Швеции, Швейцарии, Великобритании, Словении, Болгарии и на северозападе России уровень зараженности I. ricinus гранулоцитарными анаплазмами варьирует от 1 до 5%, тогда как в Италии этот показатель достигает 24,4% [8, 20, 22]. К настоящему времени у клещей показана трансфазовая передача A. phagocytophilum [18, 28]. Трансовариальная передача в клещах не установлена [22], поэтому наличие резервуара инфекции играет важную роль в распространении данного патогена. Основными резервуарными хозяевами анаплазм в США являются белоногие мыши (Peromyscus leucopus) и белохвостые олени (Odocoiles virginianus) [27, 28], а в Европе — лесные мыши (Apodemus sylvaticum), рыжие полевки (Clethrionomys glareolus), а также косули (Capreolus capreolus), олени (Cervus elaphus), овцы [11, 20—22]. Помимо I. ricinus, в поддержании паразитарной системы A. phagocytophilum в лесных районах Англии участвуют норные клещи Ixodes trianguliceps, прокармливающиеся на мелких млекопитающих [11].

Таежный клещ I. persulcatus Shculze широко распространен в таежных, лесных и лесостепных зонах России от Прибалтики до Тихого океана [1], а также в Китае [13] и Корее [19]. В настоящее время в таежных клещах обнаружено два вида эрлихий и анаплазм: Ehrlichia muris и A. phagocytophilum. Моноцитарные эрлихии E. muris, первоначально изолированные из мышевидных грызунов в Японии [29], филогенетически близки к возбудителю моноцитарного эрлихиоза человека E. chaffeensis. E. muris были обнаружены в таежных клещах на северо-западе России [8], а также в Пермской [26], Тюменской, Омской, Новосибирской областях и в Алтайском крае [6]. Уровень инфицирования таежных клещей эрлихиями варьирует от 3 до 13%. Патогенность E. muris для человека не установлена, хотя в районе распространения данного вида в Пермской области наблюдалось четыре серологически подтвержденных случая моноцитарного эрлихиоза человека после укусов клещами [26]. A. phagocytophilum была выявлена в таежных клещах на северо-западе России [3], в Алтайском и Приморском краях [6], в Китае [13] и Корее [19]. Уровень инфицирования I. persulcatus анаплазмами не превышал 4%.

В данной работе изучалось видовое разнообразие эрлихий и анаплазм в паразитарных системах, расположенных в местах, близких к оптимуму обитания таежного клеща на юге Западной Сибири (в Новосибирской и Томской областях) и на Южном Урале (Челябинская область), а также на северной границе ареала таежного клеща на Северном Урале (Свердловская область, заповедник «Денежкин камень»). ДНК эрлихий и анаплазм выявляли методом nested ПЦР в образцах от голодных имаго клещей с использованием родоспецифичных праймеров из области гена 16S рРНК. Видовую принадлежность и генетические варианты выявленных анаплазм и эрлихий определяли как при проведении ПЦР с использованием праймеров, специфичных для A. phagocytophilum и E. muris, так и посредством определения нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР [25]. Как и в предшествующих работах, было выявлено два вида эрлихий и анаплазм. ДНК E. muris была обнаружена у 8,6% клещей из Новосибирской и Томской областей, у 6,3% таежных клещей из Челябинской области и у 2,2% клещей из Свердловской области. A. phagocytophilum была выявлена у 2,4% клещей из Новосибирской и Томской областей [25], у 1,3% клещей из Челябинской и 0,7% клещей из Свердловской области. Следует отметить, что доля клещей, в которых была детектирована ДНК эрлихий и анаплазм, на Северном Урале существенно меньше, чем на Южном Урале и в Западной Сибири. Ни в одном из 87 исследованных луговых клещей Dermacentor reticulatus, собранных в Новосибирской и Омской областях, и 18 Dermacentor marginatus, собранных в Челябинской области, ДНК эрлихий и анаплазм не была обнаружена [25].

Роль резервуарных хозяев в поддержании природных очагов A. phagocytophilum в ареале распространения таежного клеща изучена очень мало. На Западном Урале (Пермская область) в образцах крови примерно у 12% рыжих полевок была выявлена ДНК A. phagocytophilum [5]. В проведенном исследовании была детектирована ДНК эрлихий и анаплазм методом nested ПЦР в крови мелких млекопитающих, отловленных в окрестностях г. Новосибирска и в заповеднике «Денежкин камень» на Северном Урале. В образцах крови зверьков, отловленных вблизи г. Новосибирска, ДНК E. muris была обнаружена в 1,1% случаев, A. phagocytophilum — в 4,2%, а ДНК двух видов — в 2,1% (табл. 1). На исследуемой территории Северного Урала доля мелких млекопитающих, в крови которых детектирована ДНК эрлихий и анаплазм, была существенно выше. ДНК E. muris была выявлена в 5,8% образцов, A. phagocytophilum — в 13,2%, а ДНК двух видов — в 1,1% образцов крови. На территории Новосибирской области эрлихии и анаплазмы были обнаружены только в образцах от лесных полевок (Clethrionomys rutilus, Clethrionomys rufocanus), а на Северном Урале — как в образцах от лесных полевок (Cl. rutilus, Cl. glareolus, Cl. rufocanus), так и от бурозубок (Sorex araneus L.) [2]. ДНК E. muris также была обнаружена в одном из трех исследованных образцов от пашенной полевки Microtus agrestis. Вероятнее всего, резервуарными хозяевами могут служить мелкие млекопитающие различных видов.

Известно, что A. phagocytophilum циркулирует в крови мелких грызунов в течение достаточно короткого времени и выявляется только в период активности иксодовых клещей [11]. Следовательно, сохранение патогена в паразитарной системе в течение зимы поддерживается клещами, а не мелкими млекопитающими. В то же время на территории заповедника «Денежкин камень» уровень инфицирования анаплазмами мелких млекопитающих значительно выше, чем таежных клещей (табл. 1). Возможно, на данной территории A. phagocytophilum циркулирует с участием других видов переносчиков.

Выявление инфекционного агента гранулоцитарного анаплазмоза человека как в клещах, так и в резервуарных хозяевах в различных регионах России свидетельствует о существовании потенциальной опасности заражения людей этим патогеном. В настоящее время имеются единичные сообщения о подтвержденных серологически случаях заболевания гранулоцитарным анаплазмозом человека на Алтае, в Новосибирской области [6], а также на Дальнем Востоке [4]. В ходе данного исследования было проанализировано 263 образца крови больных, госпитализированных в инфекционные больницы г. Новосибирска с признаками инфекционных заболеваний после укусов клещами. Ни в одном из исследованных образцов не удалось выявить ДНК эрлихий или анаплазм [7], что может быть связано как с низким уровнем инфицированности таежных клещей, так и с коротким временем бактериемии A. phagocytophilum.

Вид A. phagocytophilum объединяет в себе микроорганизмы, ответственные за развитие анаплазмоза не только у людей, но и у овец, лошадей, крупного рогатого скота, собак. Изучение внутривидового разнообразия проводится сравнением нуклеотидных последовательностей как вариабельных генов [10, 14], так и консервативных: groESL оперона [10, 24] и гена 16S рРНК [10, 13, 24]. В настоящее время нет однозначных данных о корреляции между определенными генетическими вариантами анаплазм и их биологическими свойствами. Ген 16S рРНК считается золотым стандартом для классификации бактерий. Анализ имеющихся в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей рибосомального гена A. phagocytophilum позволяет выделить, по крайней мере, семь генетических вариантов анаплазм, различающихся по расположенному вблизи 5’ конца гена вариабельному участку [13] (табл. 2).

Таблица 1

Выявление эрлихий и анаплазм в иксодовых клещах и в образцах крови мелких млекопитающих

Таблица 2

Сравнение вариабельных участков гена 16 S рРНК генетических вариантов A. phagocytophilum (позиции 75—86 п.н.
по последовательности A. phagocytophilum GenBank U02521)

Примечание. Вариабельные нуклеотидные остатки в последовательности затенены

Наиболее широко распространенные первые два генетических варианта были выявлены в иксодовых клещах и в млекопитающих различных видов как в Европе, так и в США. В крови больных анаплазмозом людей обнаружены ДНК A. phagocytephilum также только первых двух геновариантов. Напротив, генетические варианты 5 и 6 до последнего времени были выявлены только в таежных клещах в Китае [13], а варианты 4 и 7 — только в Европе. В настоящих исследованиях показано, что нуклеотидные последовательности фрагмента рибосомального гена A. phagocytophilum от таежных клещей, собранных на Северном и Южном Урале, а также из образцов крови мелких млекопитающих из Новосибирской и Свердловской областей соответствовали широко распространенному генетическому варианту 2 [2]. Этот же генетический вариант был выявлен ранее в Пермской области [5]. В то же время последовательности фрагмента рибосомального гена анаплазм, обнаруженные в трех образцах от таежных клещей из Новосибирской области (GenBank AY587607), соответствовали редкому генетическому варианту 6, обнаруживаемому ранее только в Китае (см. табл. 2) [25]. Случай обнаружения двух различающихся генетических вариантов A. phagocytophilum в Новосибирской области, один из которых выявляется только в лесных полевках, а другой в таежных клещах, представляет особый интерес и требует дальнейшего изучения. Все определенные нуклеотидные последовательности E. muris были идентичны друг другу (GenBank AY587608) и отличались от последовательности E. muris, изолированной из крови Eothenomys kageus в Японии (GenBank U15527) по одной нуклеотидной замене.

Таким образом, в исследуемых паразитарных системах на юге Западной Сибири и на Урале были обнаружены моноцитарные эрлихии E. muris и возбудитель гранулоцитарного анаплазмоза человека A. phagocytophilum как в имаго I. persulcatus, так и в крови мелких млекопитающих. Анализ последовательностей гена 16S рРНК A. phagocytophilum выявил два генетических варианта анаплазм, один их которых был обнаружен только в таежных клещах в Новосибирской области и соответствовал генетическому варианту, детектированному ранее в Китае в I. persulcatus.

Исследование поддержано РФФИ (проект № 05-04-48962а).

Литература

1. Будыко М.И. Климат и жизнь. Л.: Гидрометеоиздат, 1971.
2. Ливанова Н.Н., Рар В.А., Ливанов С.Г., Иголкина Я.П. Разнообразие паразитарных систем с участием мелких млекопитающих и Ixodes persulcatus Shculze на Северном Урале // Сиб. эколог. журн. 2005. Т. 10. № 5. С. 1079—1084.
3. Семенов А.В., Алексеев А.Н., Дубинина Е.В. и др. Выявление генотипической неоднородности популяции Ixodes persulcatus Shculze (Acari: Ixodidae) северо-запада России и особенности распределения клещевых патогенов — возбудителей болезни Лайма и эрлихиозов в различных генотипах // Мед. паразитология. 2001. Т. 3. С. 11—15.
4. Сидельников Ю.Н., Медянников О.Ю., Иванов Л.И., Здановская Н.И. Первый случай гранулоцитарного эрлихиоза на Дальнем Востоке Российской Федерации // Клинич. медицина. 2003. Т. 81. С. 67—68.
5. Телфорд С.Р., Коренберг Э.И., Гойберт Х.К. и др. Выявление в России природных очагов бабезиоза и гранулоцитарного эрлихиоза // Журн. микробиологии. 2002. №
6. С. 21—25. 6. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Ястребов В.К. и др. Новые данные о выявлении эрлихий и анаплазм в иксодовых клещах в России и Казахстане // Мед. паразитология и паразитар. болезни. 2004. №. 2. С. 10—14.
7. Фоменко Н.В., Рар В.А., Романова Е.В. и др. Молекулярно-генетический анализ инфекций, переносимых клещами, у больных Новосибирской области // Молекуляр. медицина. 2005. Т. 4. С. 48—52.
8. Alekseev A.N., Dubinina H.V., Van De Pol I., Schouls L.M. Identification of Ehrlichia spp. and Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks in the Baltic regions of Russia // J. Clin. Microbiol. 2001. V. 39. P. 2237—2342.
9. Bakken J.S., Dumler J.S. Human granulocytic ehrlichiosis // Clin. Infect. Dis. 2000. V. 31. P. 554—560.
10. Bjoersdorff A., Bagert B., Massung R.F. et al. Isolation and characterization of two European strains of Ehrlichia phagocytophila of equine origin // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002. V. 9. P. 341—343.
11. Bown K.J., Begon M., Bennett M. et al. Seasonal dynamics of Anaplasma phagocytophila in a rodenttick (Ixodes trian-guliceps) system, United Kingdom // Emerg. Infect. Dis. 2003. V. 9. P. 63—70.
12. Buller R.S., Arens M., Hmiel S.P. et al. Ehrlichia ewingii, a newly recognized agent of human ehrlichiosis // N. Engl. J. Med. 1999. V. 341. P. 148—155.
13. Cao W.C., Zhao Q.M., Zhang P.H. et al. Prevalence of Anaplasma phagocytophila and Borrelia burgdorferi in Ixodes persulcatus ticks from Northe Eastern China // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2003. V. 68. P. 547—550.
14. Carter S.E., Ravyn M.D., Xu Y. et. al. Molecular typing of the etiologic agent of human granulocytic ehrlichiosis // J. Clin. Microbiol. 2001. V. 39. P. 3398—3401.
15. Chen S.M., Dumler J.S., Bakken J.S., Walker D.H. Identification of a granulocytotropic Ehrlichia species as the etiologic agent of human disease // J. Clin. Microbiol. 1994. V. 32. P. 589—595.
16. Dawson J.E., Anderson B.E., Fishbein D.B. et al. Isolation and characterization of an Ehrlichia sp. from a patient diagnosed with Human ehrlichiosis // J. Clin. Microbiol. 1991. V. 29. P. 2741—2745.
17. Dumler J.S., Barbet A.F., Bekker C.P. et al. Reorganization of genera in families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and 'HGE agent' as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophilum // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 2145—2165.
18. Hodzic E., Fish D., Maretzki C.M. et al. Acquisition and transmission of the agent of human granulocytic ehrlichiosis by Ixodes scapularis ticks // J. Clin. Microbiol. 1998. V. 36. P. 3574—3578.
19. Kim C.M., Kim M.S., Park M.S. et al. Identification of Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma phagocytophilum, and A. bovis in Haemaphysalis longicornis and Ixodes persulcatus ticks from Korea // Vector Borne Zoonotic Dis. 2003. V. 3. P. 17—26.
20. Liz J.S., Anderes L., Sumner J.W. et al. PCR detection of granulocytic ehrlichiae in Ixodes ricinus ticks and wild small mammals in western Switzerland // J. Clin. Microbiol. 2000. V. 38. P. 1002—1007.
21. Liz J.S., Sumner J.W., Pfister K., Brossard M. PCR detection and serological evidence of granulocytic ehrlichial infection in roe deer (Capreolus capreolus) and chamois (Rupicapra rupicapra) // J. Clin. Microbiol. 2002. V. 40. P. 892—897.
22. Ogden N.H., Bown K., Horrocks B.K. et al. Granulocytic Ehrlichia infection in ixodid ticks and mammals in woodlands and uplands of the U.K. // Med. Vet. Entomol. 1998. V. 12. P. 423—429.
23. Parola P., Davoust B., Raoult D. Tick- and flea-borne rickettsial emerging zoonoses // Vet. Res. 2005. V. 36. № 3. P. 469—492.
24. Petrovec M., Bidovec A., Sumner J.W. et al. Infection with Anaplasma phagocytophila in cervids from Slovenia: evidence of two genotypic lineages // Wien Klin. Wochenschr. 2002. V. 31. P. 641—647.
25. Rar V.A., Fomenko N.V., Dobrotvorsky A.K. et al. Tickborne pathogen detection, Western Siberia, Russia // Emerg. Infect. Dis. 2005. V. 11. P. 1708—1715.
26. Ravyn M.D., Korenberg E.I., Oeding J.A. et al. Monocytic Ehrlichia in Ixodes persulcatus ticks from Perm, Russia // Lancet. 1999. V.
27. P. 722—723. 27. Tate C.M., Mead D.G., Luttrell M.P. et al. Experimental infection of white-tailed deer with Anaplasma phagocytophilum, etiologic agent of human granulocytic anaplasmosis // J. Clin. Microbiol. 2005. V. 43. P. 3595—3601.
28. Telford S.R., Dawson J.E., Katavolos P. et al. Perpetuation of the agent of human granulocytic ehrlichiosis in a deer tickrodent cycle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 11. P. 6209—6214.
29. Wen B., Rikihisa Y., Mott J. et al. Ehrlichia muris sp. nov., identified on the basis of 16S rRNA base sequences and serological, morphological, and biological characteristics // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45. P. 250—254.

Бюллетень сибирской медицины, 2006. Приложение 1 Поступила в редакцию 06.01.2006 г.