А.Д. Аммосов. Клещевой энцефалит. Кольцово. 2002г.

Содержание

4. Молекулярная биология вируса клещевого энцефалита

4.1. Морфология и структурно-функциональные
характеристики флавивирусов

Возбудитель острого и хронического клещевого энцефалита — ВКЭ — как и вирионы всех флавивирусов, имеет сферическую фор­му диаметром до 50–60 нм, покрытую гликопротеиновой обо­лочкой. Внутри внешней оболочки размещается вирусный капсид — геномный нуклеопротеиновый комплекс, покрытый коровым бел­ком диаметром около 30 нм. В своем составе ви­русная частица со­держит 68% белка, 8% РНК, 17% липидов и 9% уг­ле­­­водов.

Неионные детергенты, такие, как тритон-Х, солюбилизируют оболочку вируса, удаляя все белки оболочки; дезоксихолат натрия снимает только бислойную мембрану внешней оболочки, оставляя коровый белок ассоциированным с нуклеокапсидом вируса. Об­ра­ботка протеазами выявляет, что якорная часть гликопротеина оболочки вируса утоплена в липидном бислое. Оболочка флави­вирусов защищает геном вируса от внутриклеточных протеаз, а раздетый нуклеокапсид деградируется рибонклеазами. Во внешней среде в составе мозговой суспензии на физиологическом растворе полностью собранная частица ВКЭ сохраняет жизнеспособность при комнатной температуре до 10 дней. Вирус устойчив в кислой среде, в частности, в составе желудочного сока; вирус в крови или его суспензия в белковом растворе инактивируются при 56°С в течение 30 мин. Кипячение убивает вирус в течение 2–3 мин. В глубоко за­мороженном виде или лиофилизированном состоянии в вакууме вирус сохраняет жизнеспособность многие годы. Бла­годаря би­слойной липидной природе оболочки вирус чув­ст­вителен к эфиру, растворам лизола, спиртам.

Геном флавивирусов в составе нуклеокапсида представлен одной молекулой однонитчатой РНК положительной полярности общей длиной около 11 тыс. нуклеотидов, кото­рые кодируют по­ли­пептидную цепь длиной 3,4–3,6 тыс. амино­кислотных ос­тат­ков (а.о.). Вирусная РНК cодержит 7-метилгуано­зиновый кэп на 5’-конце. Геномная РНК служит в качестве мРНК для внутри­кле­точного синтеза вирусных белков. Для сборки зре­лого флави­вируса синтезируются 3 вирусных структурных белка: капсидный белок С, мембранный белок М и поверхностный белок Е. Не­зре­лые внутриклеточные вирусные частицы содержат глико­зи­ли­ро­ван­ный белок-предшественник рreM. Кроме того, в геноме флави­ви­русов закодированы неструктурные белки NS1-NS5, ви­русная РНК-полимераза, которые обнаружены в инфи­ци­рованной клетке и участвуют в репликации вируса. В геноме все белки закоди­ро­ва­ны последовательно в виде одной открытой рамки счи­тывания. Индивидуальные белки вируса образуются в результате ко- или пост­трансляционного расщепления единого вирусного полипро­теи­на-предшественника протеазами вирусного или кле­точного про­ис­хождения.

В репликативном цикле геномная РНК является инициа­тором инфекционного процесса и служит матрицей для создания дочерних копий.

4.2. Организация генома ВКЭ и экспрессия структурных и неструктурных вирусных белков

Нуклеотидная последовательность всего генома ВКЭ и полная ами­нокислотная последовательность полипротеина вируса рас­шифрованы Плетневым с соавторами [19]. На рис. 2 представлена линейная генетическая карта вируса с указанием кодируемых генов всех структурных и неструктурных белков и концевых не­транслируемых областей генома ВКЭ штамма Софьин. Этот штамм вируса выделен от больного на Дальнем Востоке еще в 1937 г., прошел несколько десятков пассажей на лабораторных жи­вотных и пермиссивных клетках. Широко известен как про­то­типный штамм регионального дальневосточного генетического субтипа или антигенного серотипа ВКЭ.

Немного позже были расшифрованы полная нуклеотидная по­следовательность генома ВКЭ западного штамма Neudoerfl (Найдорф) [25], дальневосточного штамма 205 [30] и другого ви­­руса из антигенного комплекса ВКЭ — вируса Повассан [73].

Длина одноцепочечной РНК генома ВКЭ штамма Софьин сос­тавляет 10477 нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов содержит единственную открытую рамку считывания белка (поз. 127–10363), кодирующую 3412 а.о. полипротеина. С 5’-кон­ца генома 126 нуклеотидов предшествуют инициирующему тран­с­крип­цию кодону AUG; затем следует открытая рамка считывания полипротеина-предшественника всех структурных и неструк­тур­ных белков вируса длиной 10236 нуклеотидов. В другом конце полинуклео­тидной последовательности геномной РНК пред­став­лены UAA-стоп кодон и 112 нуклеотидов её 3’-нетранслируемой области.

Первым с N-концевой части полипротеина ВКЭ находится нук­леокапсидный кор-белок С, состоящий из 111 а.о. Моле­ку­ляр­­­ная масса белка С равна 12108 Da. При сборке вируса он вмес­те с геномной РНК образуют центральную структурную компоненту нуклеокапсида. Коровый белок обогащен остатками основных аминокислот: доля остатков аргинина и лизина, по-видимому, необходимых для нейтрализации зарядов на РНК при ее упаковке в нуклеокапсид, составляет 21,4%. Следующим от N-конца фрагментом полипротеина, выщепляемым протеазами, является гликопротеин preM-полипептид длиной 168 а.о. PreM яв­ляется только предшественником в синтезе вирионного бел-
ка М, его нет в составе зрелого вириона в крови, не удается об­­на­ружить его и в зараженных вирусом клет­ках. Мембранный белок М, содержащийся в составе оболочки зре­лого вируса, пред­ставлен 75 остатками аминокислот, имеет мо­ле­кулярную массу 8209 Da. В С-концевой части белка нахо­дятся два гидрофобных уча­стка, разделенных остатком аргинина. Подобные последо­ва­тельности имеются в белках М всех пред­ставителей флавивирусов. По-ви­ди­мому, они обеспечивают этим белкам трансмембранную лока­лизацию и важны для посттранс­ля­ционной модификации.

Следующим отщепляемым от предшественника полипеп­ти­дом является наиболее важный поверхностный вирионный бе-лок Е. Полипептидная цепь белка Е, включающая 496 а.о. с мо­леку­лярной массой 53680 Da, заканчивается двумя гид­ро­фоб­ны­ми участками, вероятно, служащими трансмембранным «яко­рем» белка. Белок Е слабоосновный, так как 47 остатков аспа­ра­гина и глутаминовой кислоты приходятся на 50 остатков основ­ных ами­нокислот. Считается, что процессинг полипротеина между белком Е и неструктурным белком NS1 осуществляет связанная с мембранами аппарата Гольджи протеиназа. Структура сайта про­теолиза между этими белками высококонсервативна у всех фла­вивирусов. С учетом вклада гликозилирования (2 % от массы бел­ка) молекулярная масса гликопротеина Е составляет
55000 Da. В вирионном белке Е гликозилирование происходит только по одному месту (поз.154 а.о.) полипептидной цепи. Нук­лео­тидная последовательность генов структурных белков ряда фла­вивирусов была опубликована ранее [20, 21].

Расщепление полипротеинов флавивирусов протеиназой со специфичностью к последовательности Val-X-Ala, расположенной на расстоянии (–3)–(–1) от места гидролиза, обеспечивает фор­мирование N-концов белков NS2A и NS4B. По мнению авторов [19], кроме такого типа протеолиза полипротеинов флавивирусов формирование N-концевых последовательностей белков NS3, NS4A и NS5 осуществляет, по-видимому, вирусспецифическая протеиназа по последовательности, обогащенной остатками ос­нов­ных аминокислот, которым предшествуют протяженные гид­рофобные участки полипротеинов. Функцию вирусспе­ци­фической протеиназы могут, вероятно, выполнять белки preM или NS1, так как в их составе присутствуют последовательности Cys-Trp, час­то встречающиеся в активных центрах тиоловых про­теиназ. Учет этих двух типов гидролиза полипротеинов флавивирусов приводит к локализации семи неструктурных белковых продуктов (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5), наблюдаемых в инфицированных флавивирусами клетках, в том числе и при ре­п­ликации ВКЭ.

Низкомолекулярные белки NS2A, NS2B, NS4A и NS4B с М 24873, 14531, 16063 и 27585 Da, соответственно, — это гидро­фоб­ные белки с протяженными участками остатков незаряженных аминокислот. Функции этих молекул в развитии вируса в клетках только выясняются. Более высокомолекулярные белки NS1, NS3 и NS5 легко обнаруживаются в инфицированных флавивирусами клетках, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости боль­ных клещевым энцефалитом.

Нестуктурный белок NS1 (M 39162 Da) является глико­про­теином и обладает иммуногенными свойствами. Комплекс белка NS1 с гликопротеином Е отсутствует в зараженных клетках, не­смот­ря на накопление индивидуальных составляющих его субъ­единиц, только секретируется в сыворотку крови [76]. Внекле­точ­ная локализация комплекса на поздних стадиях инфекции исклю­чает его участие в созревании вирионов и создает оптималь­ные условия для индукции синтеза вирусспецифических антител. Эти антитела способны вызвать комплемент-зависимый лизис инфицированных вирусом клеток. С другой стороны, фрагменты белка NS1 экспонируются на поверхности инфицированных ВКЭ клеток и индуцируют эффекторные CTL клеточного иммунитета. Предварительная иммунизация животных белком NS1 ВКЭ, ви­русов лихорадки Денге и желтой лихорадки приводит к защите животных от высоких доз заражения этими вирусами. Однако, в сы­воротке крови животных, иммунизированных NS1 ВКЭ, не обнаруживают вируснейтрализующих антител. Известно, что мутации в NS1 влияют на вирулентность флавивирусов. Пред­по­лагается, что NS1 также воздействует на ранние процессы репликации. В инфицированной клетке этот белок обнаружи­ва­ет­ся в димерной форме, либо во фракции белка с М 49000 Da. По­следняя, по-ви­­димому, представляет собой слитую форму
NS1-NS2A, которая за счет гидрофобности цепи NS2A при­об­ре­тает способность удер­жи­ваться на клеточных мембранах.

Второй крупный неструктурный белок NS3 (68949 Da), воз­можно, обладает протеазной, геликазной и рибо-НTФ-азной актив­нос­тями. В составе третьего крупного неструктурного белка NS5 (102639 Da) всех флавивирусов присутствует последовательность, характерная для РНК-зависимых РНК-полимераз вирусов жи­вотных и растений: Gly-Asp-Asp. Белки NS3 и NS5, по-видимому, необходимы для репликации вирусной РНК, так как в зараженных клетках они находятся в околоядерной области в составе комп­лек­са с репликативной формой вирусного генома. Ассоциация комп­лекса с мембранами эндоплазматического ретикулума хозяйс­ких клеток исключает возможность контактов с системой иммуни­тета и обеспечивает репродукцию ВКЭ в организме. Изменение со­отношения составляющих субъединиц комплекса может вызы­вать переключение синтеза РНК с цепей отрицательной поляр­ности на цепи положительной полярности [76].

Разумеется, из всех белков ВКЭ более полно изучен струк­турный белок Е.

4.3. Структура и функции белка Е

Белок Е — главный, биологически наиболее значимый ком­по­нент внешней поверхности оболочки вириона. Он играет ключе­вую роль в процессах сборки вирусной частицы, в связывании вируса с клеточной поверхностью и последующем слия­нии ви­русной и клеточной мембран — определяет тропизм вируса. При сборке вириона нуклеокапсид вирусной частицы диаметром
26–30 нм, состоящий из вирусной РНК и внутривирусного нук­лео­капсидного белка С, заключается в липидный бислой, проис­хо­дящий из плазматической мембраны клетки-хозяина и вирус­ных поверхностных белков preМ и Е. Таким образом, гликопро­теин Е и белок preМ (после созревания и выхода вируса из клетки — белок М) включены в состав липопротеиновой оболочки вируса, однако, пространственно выступают на поверхности со­б­ран­ной вирусной частицы.

При обработке очищенного вирусного препарата трипсином или детергентами белок Е ВКЭ легко отщепляется от поверхности вириона в растворимом состоянии. Сохраняющаяся при этом ин­так­тная структура белковой глобулы была изучена рентгено­струк­тур­ным анализом [72]. На рис. 3 представлена схема прост­ранст­вен­ной конфигурации полипротеинов димера поверхностного белка Е ВКЭ. Из полученных данных следует, что на поверхности вируса бе­лок Е представляет собой отдельную объемную единицу, состоя­щую из комплекса двух молекул (димера) вирусного белка Е. При этом каждая молекула белка Е в димере представляет собой про­долговатое образование, состоящее из трех структурных клуб­ков-доменов (I–III), собранное определенным образом из единой полипептидной цепочки. Объемный каркас каждой мо­ле­ку­лы в ви­де трех структурных доменов белка Е жестко фиксиру­ет­ся шестью дисульфидными мостиками, образованными 12 цис­теино­выми остатками в полипептидной цепи белковой молекулы. Абсо­лютная консервативность цистеиновых остатков в составе белка Е и высокая гомологичность профиля гидрофиль­ности полипеп­тида этого белка для всех флавивирусов предполагают одинаковую пространственную структуру поверхностного белка Е флави­ви­ру­сов. Надмолекулярная димерная структура поверх­ност­ного бел­ка вируса дополнительно поддерживается межмолеку­ляр­ным взаимо­действием двух объемно протяженных молекул, стянутых вместе по принципу голова-хвост или валетом. В резуль­тате получается объ­емная симметричная структура димера с общими размерами длиной 150Е, шириной 55Е и толщиной 30Е, где боковые по­верх­ности в основном формируются I и II парными доменами, а торцевые поверхности — доменами III и частично I двух, обра­зую­щих белковый димер, молекул. Плоская структура димера располагается параллельно с поверхностью липидной бислойной мембраны вириона, и в результате, как считается, белок Е обра­зует на поверхности вируса объемно-решетчатую сеть толщиной 30Е.

Результаты рентгеноструктурного анализа подтверждаются дан­ными визуализации вирионов флавивирусов методом элект­рон­ной микроскопии. Выступающие на поверхности вириона сво­бодные участки димера белка Е, состоящие из двух димеро­обра­зую­щих парных доменов I, II и дистальных доменов III, свя­зы­вают нейтрализующие вирус иммунопротективные антитела. Не удивительно, что мутации, расположенные на поверхности ди­ме­ра, как будет рассмотрено ниже, могут иметь серьезные послед­ствия в патогенезе инфекции.

С использованием набора моноклональных антител (МКА) изучены иммунохимические свойства и проведено картирование антигенных детерминант на димере белка Е. На рис. 3 показаны то­пологические связи, серологическая специфичность и функции отдельных эпитопов, представляемых различными клонами МКА против белка Е штамма Найдорф западного серотипа ВКЭ [15].

На основании метода конкурентного связывания МКА были определены три неперекрывающиеся антигенные домена А, В и С, каждый из которых состоит из нескольких эпитопов А1–А5, В1–В5 и С1–С6, которые проявляют различные функции и се­ро­ло­гическую специфичность. Более того, МКА выявили три изоли­рованных эпитопа вне антигенных доменов i1–i3. Домен А содер­жит не только перекрестно реагирующие между различ­ны­ми фла­вивирусами эпитопы А1 и А2, но также специфические к субтипам ВКЭ эпитопы А3 и А4. Большинство эпитопов анти­ген­ного домена В специфичны к вирусам комплекса клещевого энцефалита, тогда как домен С преимущественно содержит специ­фические к ви­рус­ным субтипам эпитопы. Вируснейтрализующую активность проя­ви­ли МКА, соответствующие эпитопам А3, А4, А5, В1, В2, В4, В5, С1 и i2. Примечательно, что эпитопы внутри каждого анти­ген­ного домена показывали одинаковые структурные свойства: чув­ствительность к денатурации при низких рН, про­теолизу и вос­становлению дисульфидной связи. Это, несомненно, подт­вер­ж­дает, что антигенные домены соответствуют хорошо известным стуктурным доменам белка Е.

Семь из вышеназванных эпитопов, в которых точечные му­та­ции за­­мещения аминокислотных остатков ведут к потере нейт­ра­­лизации вируса соответствующими МКА (escape mutations), со­­средоточены в двух больших не перекрывающихся участках, ан­тигенных доменах С и А, соответствующих пространственным доменам I и II белка Е. Антигенные домены разобщены не только пространственно, но и отличаются по их чувствительности к кон­­­формационным изменениям и фрагментации. Оба антигенно реактивных участка вовлекаются в реакции нейтрализации вируса, но домен А содержит так называемые конформационные антигены, тогда как домен В — антигены, резистентные к конформационным изменениям и денатурации. Антигенный домен В, соответ­ствую­щий структурному домену III белка Е, представляет собой доста­точ­но автономное образование. Он может быть отщеплен от осталь­ной части белковой молекулы трипсиновой обработкой на­тив­ного вириона или синтезирован отдельно, как генно-инже­нерный продукт, экспрессией рекомбинантной ДНК. Однако, в обоих случаях ведущая к нейтрализации вируса иммуно­хи­ми­чес­кая актив­ность антигенного домена В реализуется только при сохранности дисульфидного мостика внутри соответствующего структурного домена III белка Е. Как предполагается авторами, не исключено, что представленные отдельные эпитопы МКА со­с­тав­ляют только части центров связывания нейтрализующих ан­ти­тел, составлен­ных из фрагментов различных субъединиц белка на нативной структуре поверхности вириона. Хотя отсут­ст­вует спе­циальное подтверждение, но часть центров нейтрали­за­ции ви­руса на белке Е, возможно, потеряна при получении со­люби­ли­зи­рованного димера.

Локализация антигенных доменов на полипептидной карте белка Е показала, что структурный домен I образован N-конце­выми 50 а.о. полипептида вместе с фрагментом 125–200 а.о., со­­держащим сайт гликозилирования белка Е, и другим фрагментом 250–300 а.о. Внутренние фрагменты полипептида 50–125 и
200–250 а.о. образуют домен II белка Е. Следующие около 100 (301–395) а.о. полипептида белка Е составляют структурный до­мен III. Последние 50 а.о. с самого С-конца полипептида со­с­тав­ляют якорную цепочку белка Е в бислойной липидной мемб­ра­не вириона.

Белок Е штамма Софьин дальневосточного генотипа и серо­типа ВКЭ, по данным работы [16], образует также три функцио­нально гетерогенных антигенных домена Е1–Е3. Еще два изо­ли­ро­ванных эпитопа не входят в домены Е1–Е3. Эпитопная карта бел­ка Е ВКЭ штамма Минск-256 (европейский генотип) содержит два основных домена Е1, Е2, и два эпитопа изо­лированы от остальных. Наибольшее отличие состоит в том, что домены Е1 и Е2 перекрываются через МКА 2Н3 и 13D6, а также наблюдаются «перестановки» эпитопов 1А2 и 1Н11, 14D5 и 13D6 в доменах Е1 и Е2, соответственно. Домен Е3 и изоли­ро­ван­ные эпитопы остаются без изменений. У штамма Софьин эпито­пы, участвующие в нейтрализации вируса, в доменах Е1 и Е2, соответственно, образуют один основной сайт. По модели Heinz у вируса штамма Найдорф все три основных домена содержат нейт­рализующие эпи­топы. У штамма Софьин основные эпитопы нейтрализации вируса расположены в районе 375–471 а.о. линей­ной карты белка Е. В этом районе белка Е локализованы домены нейтрализации и других флавивирусов: вируса японского энцефа­ли­та (303–396 а.о.), вируса энцефалита долины Мюррей (390 а.о.), вируса ли­хорадки Денге (280–414 а.о.).

Таким образом, эпитопное картирование белка Е различных штаммов ВКЭ при помощи различных авторских серий МКА к этому белку, в общем случае, согласуется с выше обсуждавшимися результатами структурных исследований димерного комплекса этого белка штамма Найдорф, с трехдоменным объемным пред­став­лением о нем. Идентификация иммуноактивных участков бел­­ка Е ВКЭ штамма Софьин с помощью его синтетических пептид­ных фрагментов показала [47, 48]: антитела к пептидным фрагментам белка Е в поз.98–113 и 394–403 а.о. являются вирус­нейтрализующими; пептид, соответствующий а.о. белка Е
35–51, является частью конформационно зависимого В-эпитопа белка Е; в ряду потенциальных Т-эпитопов выявлены пептиды 48–74, 90–113, 204–224, 275–302 и 377–403, иммуногенные в свободном виде без коньюгации с белком-носителем и содержащие Т-хел­пер­ные эпитопы; пептиды 204–224, 275–302 и 377–403 способны эффективно связываться с противовирусной сывороткой человека и входят в состав В-эпитопов вируса; по ингибированию слияния вируса с макрофагами, липосомами и с применением МКА уста­нов­лено, что полипептидный фрагмент белка Е
98–113 является участ­ком слияния ВКЭ с эндосомальной мемб­ра­ной клетки-хозяи­на. По мнению авторов работы [15], полипеп­тид­ный фрагмент 398–413 а.о. белка Е ВКЭ, вирусов Западного Нила, DEN-2 и желтой лихорадки по характерному профилю своей гидрофобности соответствует иммунодоминантному Т-кле­­точ­ному сайту. Таким образом, белок Е флавивирусов по сво­им структурно-функцио­нальным свойствам определяет не только тро­пизм вируса, но также играет, по-видимому, во многом ключевую роль в вирулентности вируса, развитии гуморального и клеточного иммунитета.

4.4. Репликативный цикл флавивирусов

ВКЭ характеризуется широким клеточным тропизмом и мо­жет размножаться in vitro во многих клеточных линиях мле­ко­пи­тающих, членистоногих и птиц. Однако, не только у ВКЭ, но так­же у всех флавивирусов связывание вируса с поверхностью пермиссивных клеток и начальные события вирус-клеточного взаи­модействия до сих пор детально не изучены. При помощи ан­тиидиотипических антител, имитирующих гемагглюти­нирую­щие эпитопы белка Е, показано, что в качестве специфических рецепторов ВКЭ на поверхности клеток может выступить лами­ниновый рецептор человека [57]. Также предполагается, что в организме сорбция и дальнейшее необратимое связывание вириона с клеткой может быть опосредовано С3 компонентом компле­мен­та, Fc детерминантой иммуноглобулинов или с участием специ­фических антител, когда уровни их концентрации ниже, чем ней­трализующие титры [40]. После прикрепления к клеточной по­­верхности вирионы флавивирусов локализуются во впячивани­ях клеточной мембраны, где они подвергаются эндоцитозу с об­ра­зованием эндоцитозных везикул (пузырьков). Иногда может наблю­даться и прямое слияние мембран. Детальные механизмы процессов раздевания вируса, трансляции внедренной в клетку ви­русной РНК в вирусный полипротеин с процессингом протеазами в структурные и неструктурные вирусные белки, репликации ви­русной геномной РНК, сборки нового нуклеокапсида и формиро­вания зрелого, инфекционного вириона с участием клеточных компонентов и структур пока не исследованы.

Предполагаемая схема внутриклеточного жизненного цикла флавивирусов представлена на рис. 4 [41]. После стадий связы­ва­­ния с клеткой, эндоцитоза вирионов, слияния и расплавления мембран происходит раздевание нуклеокапсида и освобождение геномной РНК в цитоплазме. Далее следуют сложные совмещенные стадии трансляции и процессинга полипротеина (синтеза струк­тур­ных и неструктурных вирусных белков) с ассоцииро­ван­ной с мем­браной репликацией — размножением (+)- и (–)-це­пей новой вирусной РНК. Затем вновь синтезированная (+)-цепь вирусной РНК комплексуется с preM, M и С-белками в вирусный нук­лео­капсид. Дальнейшая сборка вириона с участием поверхностного Е белка и созревание полного инфекционного ви­руса происходят в клеточных структурах и окончательно завер­ша­ются в процессе транспортировки вирусов через клеточную мем­б­рану. Вирионы созревают по мере передвижения из шеро­ховатого эндоплаз­мати­чес­кого ретикулума в гладкий, затем в аппарат Гольджи и, нако­нец, в плазматическую мембрану клетки.

Созревание вируса с повышением его инфекционной актив­ности также связывают с делеционным расщеплением preM белка с образованием структурного белка М зрелого вириона ВКЭ. Это расщепление встречается перед самым высвобождением вириона из клетки или одновременно с процессом транспортировки вириона через клеточную мембрану (Рис. 5). Как предполагается, антитела к preM белку могут способствовать протективному иммунитету путем нейтрализации содержащих preM-антиген вирионов, на­хо­дящихся на клеточной поверхности.

При инфицировании флавивирусами некоторых линий клеток позвоночных наблюдается образование дефектных вирусных частиц с неполным геномом или с нарушенным порядком распо­ло­жения генов в геномной РНК, так называемых дефектных ин­тер­ферирующих вирусных частиц, секретируемых в возрас­таю­щих концентрациях с ростом числа пассажей. Синтез интерфе­ри­рующих частиц характерен для персистентной хронической инфекции. Как было показано, у мышиной линии, резистентной к флавивирусной инфекции, это свойство придается наличием оди­ночного аутосомально-доминантного локуса в геноме, назван­ного Flv и картированного на пятой хромосоме [40,74]. В инфи­ци­рованной культуре первичных фибробластов от резистентной мыши синтез вирусной РНК ограничен, титр ин­фек­ционного ви­ру­са низок, а доля дефектных интерферирующих частиц значи­тельна в результате только одного пассажа. Флави­ви­русы могут реплицироваться в организме резистентной мыши, но развитие инфекции замедлено, максимальная виремия на 3–4 порядка ниже, чем у нормальной мыши [41]. Эти эксперименты показали, что до сих пор не идентифицированный специфический хозяйский ген может драматически влиять на синтез флавиви­рус­ной РНК, на характер репликации вируса в клетке. Однако, в какой степени аналогичный механизм подавления реплика­тив­ной инфекции может реализоваться в частном случае широко распространенного персистентного клещевого энцефалита у человека, пока не иссле­довано.

Новая информация, расскрывающая связь между механиз­мом репликации вируса в инфицированной клетке и патогенезом инфекции клещевого энцефалита получена Морозовой О.В. в ре­зуль­тате изучения репликативного комплекса ВКЭ с участием кле­точных и вирусных неструктурных белков NS5, NS3 и ви­рус­ной РНК. На основании полученных результатов предпола­га­ется, что РНК-зависимый синтез может регулироваться при помо­щи изменения состава внутриклеточного комплекса вирусных и клеточных белков. Выход белка NS5 из состава комплекса при­во­дит к нормальному переключению синтеза с «минус»-цепей РНК на геномные РНК и, следовательно, к развитию репликатив­ной инфекции. Уменьшение относительных количеств белка NS3 в составе ассоциированного с мембранами комплекса вирусных белков, возможно, ингибирует скорость синтеза геномных РНК, что приводит к реализации процесса медленной персистентной инфекции [76].

Клетки, инфицированные флавивирусами, кроме зрелых и де­­фектных вирусных частиц также секретируют медленно седи­мен­тирующие частицы с внешним размером 14 нм, состоящие из корпускулярных агрегатов Е и М белков вируса. Как показано, эти неинфекционные частицы вирусного происхождения являются эффективными иммуногенами в синтезе антител с нейтрали­зую­щими вирус, протективными свойствами.

В инфицированных флавивирусами клетках происходят хоро­шо заметные ультраструктурные изменения, включая вакуоли­за­цию, пролиферацию внутриклеточных мембран. Инфекция часто цитоцидна, хотя часть клеток сохраняется и, таким образом, ста­­новится хронически инфицированной. Даже на стадии мак­си­мальной репликации вируса значительного ингибирования син­теза клеточных макромолекул не наблюдается.

Кроме человека, ВКЭ также высокопатогенен для обезьян и белых мышей. Малочувствительны к нему кролики, морские свин­ки. В экспериментальной инфекции наряду с высокочувстви­тель­ной и низкочувствительной моделями белой мыши и морской свин­ки промежуточную позицию по чувствительности к развитию нейропатологии клещевого энцефалита занимают сирийские хо­мячки. Из домашних животных к инфекции клещевого энцефа­ли­та восприимчивы поросята и овцы. Козы и коровы также инфи­ци­ируются ВКЭ, однако инфекция часто ограничивается кратко­временной вирусемией с проникновением вируса в молоко живот­ных [2, 3, 41]. В результате нападения клещей в организме теп­­­­ло­кровных животных развиваются специфические защитные реакции и при повторном присасывании клещей к иммунным жи­­вотным у паразитов могут резко нарушаться процессы насы­ще­ния и наступить их гибель [53].