А.Д. Аммосов. Клещевой энцефалит. Кольцово. 2002г.

Содержание

7. Методы и средства лабораторной диагностики клещевого энцефалита
и их применение в клинической практике

7.1. ИФА Е антигена ВКЭ и антител к нему

Для выявления инфицирования вирусом и установления диаг­ноза клещевого энцефалита повсеместно используются лабо­раторные методы иммуноферментного анализа антигенов ВКЭ и антител к ним в сыворотке крови пациента. Анализ Е антигена ВКЭ также часто используется для определения инфицирован­нос­ти клеща, снятого с укушенных. Эти анализы основаны на реак­ции взаимодействия антиген — антитело с применением мече­ных ферментом антител для индикации результатов. В качестве приме­ра ниже приводятся краткие описания иммуноферментых тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» для клинического лабораторного анализа вирусного антигена и антител к ВКЭ.

ИФА Е антигена ВКЭ. Тест-система предназначена для выяв­ления ВКЭ в клещах и ликворе человека или животных и может быть использована в клинических и эпидемиологических иссле­до­ваниях.

В наборе реагентов тест-системы фирма поставляет готовые для проведения анализа стрипированные планешеты с предвари­тель­но иммобилизованными антителами. Одностадий­ный анализ антигена состоит в совместном инкубировании иссле­дуемого об­разца с конъюгатом моноклональных антител про­тив Е антигена ВКЭ с пероксидазой в лунках стрипов с пред­ва­рительно им­мо­би­ли­зованными антителами против ВКЭ. Реакционная смесь в лун­ках выдерживается во влажной камере 3 ч при 37°С или 16–20 ч при комнатной температуре. После удаления и промывки лунок от не связавшихся реагентов вирусный антиген в иссле­дуемой пробе проявляется реакцией ферментного конъюгата с субстратом, дающим окрашенный раствор в течение 25–30 мин при комнатной температуре. Оптическая плотность субстрата, оп­­ре­деляемая спект­рофотометрически, пропорциональна кон­цен­т­рации анали­зируемого вирусного антигена. В наборах тест-систем от «Вектор-Бест» по желанию заказчика в качестве субстрата пе­­рок­сидазы поставляются ОФД или ТМБ.

ИФА антител класса IgМ к ВКЭ. Для анализа используются го­­товые к применению пластиковые планшеты или стрипы с пред­варительно иммобилизованными антителами к IgM человека. Об­разец исследуемой стократно разведенной сыворотки инкуби­руется в течение часа при 37°С в лунках планшеты с антителами к IgM человека для связывания суммарной фракции антител клас­са IgM из анализируемой сыворотки. По окончании времени инкубации не связавшиеся компоненты сыворотки удаляются, и планшета промывается. Для связывания с вирусоспецифическими антителами IgM на планшете антигенов ВКЭ и меченых антител про­водится вторая инкубация планшеты с предварительно сме­шан­ным реагентом антигенов ВКЭ и конъюгатом МКА к ВКЭ с фер­ментом-пероксидазой при тех же условиях. После второго уда­­­ления и промывки не связавшихся компонентов наличие спе­ци­фических антител класса IgM к ВКЭ в исследуемой сыворотке определяется последующим проявлением активности и измерением оптической плотности окрашенного субстрата конъюгированного фермента.

Тест-система укомплектована контрольными сыворотками и всеми реагентами, готовыми для работы, снабжена соответст­вую­­щей инструкцией по применению.

ИФА антител класса IgG к ВКЭ. По желанию заказчика тест-­системы комплектуются готовыми к работе планшетами или стрипами с заранее иммобилизованным антигеном ВКЭ. В соот­вет­ствии с инструкцией разбавленная в 100 раз исследуемая сыво­рот­ка вносится в лунки планшеты с вирусным антигеном и инку­бируется в течение часа при температуре 37°С. В конце инкубации не прореагировавшие компоненты сыворотки удаляются, и план­шета промывается. Затем в лунки со связавшимися антителами вносится раствор ферментного конъюгата с моноклональными ан­ти­телами против иммуноглобулинов класса IgG человека. План­шета с реагентами выдерживается во второй раз в течение часа при 37°С. После удаления и промывки не связавшихся реа­гентов количество вирусспецифических IgG в исследуемой сыворотке опре­деляется последующим проявлением и измерением оптической плотности окрашенного субстрата ферментного конъю­гата в лунках планшеты. Набор реагентов тест-системы и ее инст­рукция по применению предусматривают процедуру титро­вания вирусспе­ци­фических IgG в сыворотке.

Тест-система выпускается в соответствии с требованиями ВФС 42-3503-99 и ее производство сертифицировано как меди­цин­ского иммунобиологического препарата.

7.2. ПЦР-анализ РНК ВКЭ

Методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с ПЦР геномная РНК ВКЭ определяется с применением молеку­ляр­ных зондов — меченых фрагментов нуклеиновой кислоты, комп­­лементарных к определенным участкам генома ВКЭ. Преи­мущества анализа РНК ВКЭ перед методом биопробы и анализом антигенов вируса иммуноферментным методом или методом флюо­рес­цирующих антител стали очевидными с первых работ по выяв­лению РНК ВКЭ еще простым методом гибридизации нуклеино­вых кислот [27, 28].

Первые результаты анализа РНК ВКЭ показали, что метод мо­­­лекулярной гибридизации — более высокочувствительный тест: вирусная РНК выявлена из 50,9% исследованных проб крови боль­ных с острым течением клещевого энцефалита. При исследо­вании тех же образцов крови методом биопробы на беспородных белых мышах инфекционный вирус выявлен в 23,4% случаев. По мнению авторов, столь значительное расхождение в резуль­татах анализов в сыворотке объясняется возможной маскировкой инфекционного вируса за счет формирования иммунных комп­лексов. В процессе депротеинизации при выделении РНК из ана­ли­зируемого образца нуклеопротеиновые комплексы диссоции­руют, и освобождающаяся вирусная РНК увеличивает частоту положительных результатов гибридизационного анализа. Более частое выявление РНК ВКЭ в крови больных может быть обу­слов­лено также значительно более активным, чем репликация инфекционных вирионов, синтезом вирусной РНК в инфици­ро­ванной клетке. Чувствительность гибридизационного метода, по сравнению с биотестом, при анализе ВКЭ в клещах была выше и при постановке биотеста на сосунках белых мышей, но в меньшей степени.

ЗАО «Вектор-Бест» для анализа РНК ВКЭ в клинических об­разцах поставляет тест-систему ПЦР-анализа в его наиболее выскочувствительном варианте, основанном на методе обратной транскрипции с последующей «nested» полимеразной цепной ре­ак­цией (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР включает два этапа: на первом этапе при температуре 37°С производится реакция обратной тран­ск­рипции, т.е. после специфического связывания олигонуклео­тида-праймера с вирусной РНК исследуемого образца происходит синтез вирусной кДНК с помощью обратной транскриптазы (ре­вер­тазы); на втором этапе проводится ПЦР, включающая три ста­дии. На первой стадии при температуре 93оС происходит дена­ту­рация гибридной двойной цепи РНК-кДНК, образовавшейся при обратной транскрипции. На второй стадии ПЦР два олиго­нуклеотида-праймера, строго специфичные (гомологичные) к опре­деленным участкам антипараллельных цепей вирусной РНК и кДНК, связываются с этими участками цепей нуклеиновых кис­лот (т.н. стадия отжига праймеров). На третьей стадии при темпе­ра­туре 70–72°С с участием термофильной ДНК-полимеразы (Тth-по­­лимераза) и дезоксинуклеозид-5’-трифосфатов происходит синтез новых цепей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания олигонуклеотидов-праймеров с вирусной РНК и кДНК, матрицей для копирования служат комплемен­тар­­ные цепи вирусной нуклеиновой кислоты (т.н. стадия полиме­ризации).

Таким образом, за цикл из трех стадий происходит удвоение каждого из двух фрагментов антипараллельных цепей вирусной нук­леиновой кислоты. При проведении 20 таких циклов теорети­чески происходит увеличение количества фрагмента исходной ДНК примерно в миллион раз.

Для увеличения чувствительности анализа этап ПЦР прово­дится в «nested»-варианте: первый раунд — с «внешней» парой оли­­гонуклеотидов-праймеров, второй раунд — с «внутренней» па­рой олигонуклеотидов-праймеров и аликвотой реакционной смеси ПЦР первого раунда.

Выбранные пары праймеров из NS3-области вирусного генома позволяют выявлять строго специфично все РНК ВКЭ различных штаммов. При этом РНК других флавивирусов, в том числе — из антигенной группы ВКЭ, не выявляются. Размер специфи­чес­кого ампликона в первом раунде ПЦР с «внешними» праймерами — 340 пар оснований, во втором раунде ПЦР с «внутренними» прай­­мерами — 171 пара оснований или нуклеотидных остатков. Де­текцию результатов ПЦР-анализа проводят визуально после гель-электрофореза аликвоты амплифицированной ДНК в поли­ак­­риламидном геле или агарозе. Чувствительность анализа с при­ме­нением описанной тест-системы — 100–200 геномов ВКЭ на ис­­следуемую пробу. Сверхчувствительный ПЦР-анализ РНК по­зво­ляет надежно с высокой специфичностью выявлять ВКЭ в ис­следуемых образцах, содержащих вирус в десятки-сотни тысяч раз в меньших количествах, чем это позволяет выявлять ИФА-ана­­лиз антигена ВКЭ.

Для проведения лабораторного ПЦР-анализа РНК ЗАО «Век­тор-Бест» выпускает дополнительный набор реагентов, специально предназначенный для выделения РНК из биологических образцов (крови, сывороток крови, форменных элементов крови, мочи, слю­ны, ликвора, соскобов со слизистой, культур клеток и пр.).

7.3. Лабораторная диагностика клещевого энцефалита

Внутри-, межочаговая и региональная генетическая гетеро­генность ВКЭ приводит к широкому структурному разно­об­разию эпитопов каждого из антигенов вируса. В результате сре­ди цир­ку­лирующих в природе штаммов вируса значительную часть сос­тав­ляют антигенно-дефектные варианты. Сущность яв­ле­ния анти­ген­ной дефектности заключается в отсутствии гемаг­глю­ти­нирую­щего и преципитирующего антигенов и слабой имму­ногенности на фоне высокой инфекционной активности вируса. В этих усло­виях основу иммунологических методов анализа спе­ци­фических вирусных антител составляют реакции связывания толь­ко вирус­нейтрализующих антител, продуцируемых у лиц, инфицирован­ных антигенно-дефектными вирусами в низких тит­рах. В при­род­ных популяциях ВКЭ доля соответствующих дефект­ных штам­мов может достигать 30–40% [29]. Лица, инфициро­ван­ные анти­генно-дефектными штаммами, в клинике образуют груп­пу т.н. серонегативных больных и больных с низкими ста­биль­ными титрами.

При иммунологических методах определения ВКЭ некоторая неопределенность в оценке результатов анализа также возникает из-за того, что препараты меченых антител могут связываться с вирусами различных серотипов ВКЭ с разной эффективностью. Так­же требуется проверка специфичности меченых антител от­но­сительно реакции связывания с другими флавивирусами группы клещевого энцефалита. По этим причинам в последнее время в про­изводстве ИФА-диагностикумов для клинического анализа в ка­честве меченых антител к ВКЭ используются моно­клональные ан­титела, связывающиеся с определенным эпитопом Е-антигена ВКЭ, общим для известных серотипов этого вируса.

Клиническое распознавание клещевого энцефалита на первом этапе основывается на известных клинико-эпидемиологических данных. В большинстве наблюдений удается установить пред­шест­­вующее пребывание человека в лесу, укус клеща или воз­мож­­ность употребления им сырого инфицированного молока. Сразу оценивается вероятная продолжительность инкубационного периода, а клинические исследования могут выявить нейроинфек­ци­онный характер болезни. Предварительный диагноз должен быть подтвержден лабораторным методом [3]. На практике диаг­ноз клещевого энцефалита, как правило, устанавливается приме­не­нием ИФА при четырехкратном нарастании титра вирусспе­ци­фических антител в парных сыворотках. Повторное обследование можно провести спустя 7–10 дней. Обычно антитела в высоких тит­рах обнаруживаются на 10–14-й день болезни, а иногда и раньше, и достигают высокого уровня к концу месяца. Даже однократное определение высокой концентрации вирусспецифи­ческих иммуноглобулинов класса IgM следует считать достоверным сви­детельством в пользу клинического диагноза клещевого эн­це­фа­лита. Ранние антитела IgM в сыворотке пациентов выявля­ются, начиная с первых дней после укуса клеща. Чувствитель­ность применения ИФА вирусспецифических антител класса IgM для диагностики максимальна в первой десятидневке после инфицирования. Антитела класса IgG в максимальных титрах вы­являются в течение 2–6 мес. после инфицирования. Однако, следует учитывать отсутствие антител или весьма низкий уровень продукции их у части больных в титрах не выше 1:640. При этом следует иметь в виду возможность обнаружения специфи­чес­ких антител в низких титрах в течение длительного времени у вакцинированных. Поэтому для подтверждения диагноза часто ре­комендуется применение высокочувствительного ПЦР-анализа для определения РНК ВКЭ. Определение вирусной РНК при клещевом энцефалите в образцах сыворотки, ликвора, в зависи­мос­ти от сроков выявления и корреляции с определенными соот­но­шениями уровней специфических антител IgM и IgG, может служить для диагностики серонегативной формы клещевого энце­фа­лита, затяжной реконвалесценции, прогноза второй волны лихо­радки клещевого энцефалита и возможности хронизации процесса [58, 82].

В последнее время ПЦР-анализ РНК ВКЭ, метод ИФА для ин­ди­кации вирусного антигена в клещах, снятых с людей, все чаще применяются для прогноза риска заболевания клещевым энце­фалитом. При положительных результатах тестирования ре­ко­­мендуется экстренная серопрофилактика укушенного путем внут­римышечного введения специфического противоэнцефа­лит­ного человеческого иммуноглобулина [59].

Дифференциальная диагностика должна учитывать возмож­ность заболевания пациента японским энцефалитом, геморраги­чес­кой лихорадкой с почечным синдромом, энтеровирусным менин­гитом, клещевым риккетсиозом, болезнью Лайма (боррелиозом) и др.